Breeze through membrane protein stability with Uncle

Význam tématu

Membránové bílkoviny představují klíčové farmaceutické cíle, jejich stabilita je však při izolaci ze lipidové dvojvrstvy často narušena. Spolehlivá charakterizace termální a strukturální stability těchto proteinů je zásadní pro vývoj nových léčiv, vakcín i biomarkerů. Tradiční metody (DSC, NMR) vyžadují větší množství materiálu a nelze je snadno adaptovat na vyšší propustnost. Platforma Uncle nabízí komplexní přístup k profilu stability s nízkými vzorkovými objemy a vysokou rychlostí měření.

Cíle a přehled studie / článku

Studie demonstruje využití přístroje Uncle pro hodnocení stability dvou membránových proteinů, biomarkeru GPRC5D a antigenu CD20, v různých prostředích: detergentové micely, nanodisky a virus-like partikle (VLP). Cílem bylo porovnat teploty tání (Tm) a charakterizovat změny ve velikosti a agregaci pomocí více detekčních metod ze stejného vzorku.

Použitá metodika a instrumentace

Instrumentace:

• Platforma Uncle (Unchained Labs) s kompletním spektrem fluorescence, statickým (SLS) a dynamickým rozptylem světla (DLS).
• Laserové ex citace: 266 nm (tryptofan, tyrosin, fenylalanin) a 473 nm (CPM), teplotní kontrola 15–95 °C, ramping 0,6 °C/min.
• 9 µl vzorky ve speciálních křemíkových kyvetách, měření v triplikátech.
• Software Uncle Analysis pro výpočet Tm z barycentrického minima intrinsic fluorescence a CPM signálu.

Probarvení:

• Thiol-reaktivní fluorescenční barvivo CPM (7-diethylamino-3-(4-maleimidophenyl)-4-methylcoumarin) pro sledování odhalení cysteinových zbytků při unfoldingu.

Vzorky:

• GPRC5D a CD20 připravené v detergentové formulaci, nanodiscích (MSP1D1) a VLP (s izotypovým kontrolním VLP).
• Normace koncentrace cca 0,15 mg/ml (GPRC5D) a 0,25 mg/ml (CD20).

Hlavní výsledky a diskuse

Detergentní formy:

• GPRC5D: CPM Tm 46,2 °C, intrinsic fluorescence Tm 48,8 °C – rozdíl ca 2,5 °C odráží odlišné monitorované domény proteinu.
• CD20: dva CPM Tm při 43,2 a 50,9 °C bez jasného intrinsic signálu.

Nanodisky:

• GPRC5D: CPM Tm 56,6 °C (bez intrinsic Tm, signál MSP1D1 je bez cysteinů), což potvrzuje stabilizační efekt lipidové dvojvrstvy.
• CD20: CPM Tm posunuty asi o 1 °C výše (44,2 a 51,9 °C), intrinsic Tm 82,4 °C – patogenní zvýšení stability.

VLP:

• Izotypová kontrola vykázala tři unfoldingové události (37,9; 48,5; 59,0 °C).
• GPRC5D VLP: dva Tm (40,7 a 59,6 °C), CD20 VLP: dva Tm (46,4 a 56,0 °C) – vyšší stabilita ve srovnání s detergentem.
• DLS: VLP po zahřátí zmenšeny (GPRC5D z 236 na 186 nm, CD20 z 158 na 136 nm) indikující strukturální přeuspořádání či rozpouštění částic.
• SLS: pokles intenzity při ~58 °C (GPRC5D VLP) a ~69 °C (CD20 VLP) znamená disasociaci agregátů či částic.

Přínosy a praktické využití metody

Uncle umožňuje simultánní získání orthogonálních dat o unfoldingu a agregaci z malého objemu vzorku. Nízké požadavky na množství proteinu a automatizované zpracování výrazně zrychlují optimalizaci podmínek solubilizace a stabilizace membránových proteinů v preklinickém i vývojovém stádiu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Integrace s dalšími biochemickými assay (např. ligandové vazby), rozšíření throughputu nad 48 vzorků, aplikace na screening knihoven detergentů či lipidových kompozic, přenositelnost na HTS formáty a vývoj integrovaných workflow pro studium komplexních virových částic či nanokapslí.

Závěr

Platforma Uncle prokázala univerzálnost i citlivost při analýze stability membránových proteinů v tří různých prostředích. Kombinace CPM indikace, intrinsic fluorescence, SLS a DLS poskytuje ucelený obraz unfoldingových a agregančních procesů s minimálním množstvím vzorku.

Reference

• Alexandrov AI, Mileni M, Chien EY, et al. Microscale Fluorescent Thermal Stability Assay for Membrane Proteins. Structure. 2008;16(3):351–359.
• Rusnati M, Ciminale V, Andreoni F, et al. Recent strategic advances in CFTR drug discovery: An overview. Int J Mol Sci. 2020;21(7).
• Denisov IG, Grinkova YV, Lazarides AA, Sligar SG. Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins. Nat Struct Mol Biol. 2016;23(6):481–486.
• Gridley S, Mayhew ML, Mileni M, et al. Chapter 7 - Challenges and Approaches for Assay Development of Membrane and Membrane-Associated Proteins in Drug Discovery. In: Lunn CA, ed. Progress in Molecular Biology and Translational Science. Vol 91. Academic Press; 2010:209–239.
• Rodriguez-Otero P, Bazarbashi A, Palomera L, et al. GPRC5D as a novel target for the treatment of multiple myeloma: a narrative review. Blood Cancer J. 2024;14(1):24.
• Wang W, Singh SK, Zeng DL, King K, Nema S. Antibody Structure, Instability, and Formulation. J Pharm Sci. 2007;96(1):1–26.
• The UniProt Consortium. UniProt: the Universal Protein Knowledgebase in 2023. Nucleic Acids Res. 2023;51(D1):D523–D531.