Take a snapshot of your protein quality with Uncle

Význam tématu

Rychlé a spolehlivé ověření kvality proteinových vzorků před dalšími analýzami je klíčové pro výzkum i průmyslovou praxi. Stav proteinu může ovlivnit výsledky charakterizace, biologickou aktivitu a stabilitu finálního produktu. Proto je nezbytné mít nástroj, který umožní současné hodnocení konformace, velikosti a agregace s minimálním množstvím vzorku a vysokou průchodností měření.

Cíle a přehled studie

Studie představuje multifunkční platformu Uncle (Unchained Labs), která kombinuje spektrofluorescenci, statickou (SLS) a dynamickou světelnou rozptylovou analýzu (DLS) v jednom přístroji. Hlavní cíle byly:

• Ověřit schopnost zachytit tepelnou nestabilitu a agregaci monoklonálních protilátek (mAb1 a NISTmAb).
• Zhodnotit vliv opakovaných cyklů zmrazování-rozmrazování a skladování při různých teplotách na stabilitu vzorků.
• Porovnat výsledky Uncle s referenčními daty z DSC a UV/Vis kvantifikace.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky protilátek byly připraveny v pufrech sodné octanové nebo histidinové soli a naředěny na 0,5 mg/ml. Měření probíhala ve dvou krocích:

• Isotermální aplikace: záznam intrinsic fluorescence (barycentrický střed spektra, BCM) a SLS při vlnách 266 a 473 nm při 25 °C.
• Sizing & Polydispersity: čtyři DLS akvizice po 5 s pro stanovení hydrodynamického průměru a polydisperzity.

Instrumentace:

• Uncle (Unchained Labs) pro fluorescence, SLS a DLS.
• Lunatic (Unchained Labs) pro UV/Vis kvantifikaci koncentrace.

Hlavní výsledky a diskuse

Termální degradace mAb1 vedla k výraznému nárůstu BCM fluorescence a zvýšení SLS signálu při 266 nm, což indikuje vznik menších agregátů. Naopak standardní materiál NISTmAb vykázal stabilní fluorescence a SLS, potvrzené tepelným rampováním s přechody odpovídajícími literatuře (69, 83, 94 °C).
Opakované cykly zmrazování-rozmrazování způsobily u mAb1 nárůst hydrodynamického průměru až na ~20 nm, aniž by došlo k výraznému nárůstu BCM fluorescence, což svědčí o nativní agregaci bez rozsáhlého rozvinutí struktury.
Skladování mAb2 při 25 °C po dobu 7 dnů vyvolalo mírný posun BCM fluorescence, zatímco při 4 °C zůstala statická.

Přínosy a praktické využití metody

Uncle umožňuje během jediného experimentu zaznamenat tepelnou stabilitu, agregaci a velikostní charakteristiky proteinů s pouhými 9 µl vzorku a průchodností až 48 vzorků najednou. Díky kombinaci tří analýz v jednom přístroji šetří čas a materiál, což je cenné při vývoji terapeutik, optimalizaci formulací i kontrole kvality.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření platformy o další moduly pro měření viskozity, entalpických změn či interakcí s ligandem. Integrace s automatizovanými pipetovacími systémy a pokročilou datovou analýzou založenou na strojovém učení zvýší průchodnost i prediktivní sílu testů. V oblasti biosimilars a personalizované medicíny poskytne tento typ platformy rychlou odezvu na změny ve stabilitě a kvalitě proteinových produktů.

Závěr

Cílená aplikace kombinace fluorescence, SLS a DLS na platformě Uncle prokázala spolehlivou detekci tepelné nestability, agregace i změn ve velikosti proteinových vzorků. Metoda nabízí efektivní a flexibilní QC kontrolu biologik s nízkou spotřebou vzorku a vysokou průchodností.

Reference

1. John E. Schiel, Darryl L. Davis, Oleg V. Borisov. State-of-the-Art and Emerging Technologies for Therapeutic Monoclonal Antibody Characterization Volume 2. American Chemical Society, 2015.