Rapid phenotypic identification of microorganisms with Raman

Význam tématu

Ramanova spektroskopie umožňuje rychlou a neinvazivní identifikaci bakterií přímo z pevných kulturních médií.
Metoda přináší detailní biochemický profil mikroorganismů bez potřeby genetického sekvenování, čímž zkracuje dobu a náklady analýzy.
Díky tomu nachází široké uplatnění v potravinářství, environmentální analýze i biotechnologii.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem studie bylo ověřit schopnost Ramanovy spektroskopie identifikovat a odlišit bakteriální kolonie na LB agarovém médiu.
Autoři porovnávali excitaci laserem o vlnové délce 785 nm a 1064 nm a zkoumali možnost diferenciace kolonií různých morfologií a barev.

Použitá metodika

Kolonie byly získány otiskem prstu na sterilizované LB agarové médium a inkubovány při pokojové teplotě.
Spektra byla zaznamenána optickou sondou uchycenou v držáku BAC150B a zobrazena pomocí video mikroskopu BAC151C s 50× objektivem.
Nastavení zahrnovalo výkon laseru 30–100 %, integrační časy 3–60 s a průměrování 3–5 spekter.

Použitá instrumentace

• i-Raman Prime 785S (785 nm laser, chlazený CCD detektor)
• i-Raman EX (1064 nm CleanLaze laser, hluboce chlazený InGaAs detektor)
• Držák sondy BAC150B a video mikroskop BAC151C s 50× objektivem
• Software BWSpec pro akvizici a základní zpracování spekter

Hlavní výsledky a diskuse

Spektra bakteriálních kolonií obsahovala charakteristické pásy aminokyselin (1001, 1156, 1654 cm⁻¹) a DNA (723, 669, 1337 cm⁻¹).
Excitace 785 nm poskytla výraznější a ostřejší Ramanovy signály než 1064 nm, kde byla nižší autofluorescence, ale také horší rozlišení detektoru.
Různobarevné kolonie (žlutá a bílá) se odlišily přítomností pigmentových pásů u žluté formy.
PCA analýza ukázala možnost oddělení fenotypicky odlišných bakterií, přičemž pro jemnější rozlišení jsou vhodné pokročilé algoritmy strojového učení.

Přínosy a praktické využití

Analýza přímo na pevném médiu zkracuje dobu identifikace a eliminuje potřebu časově náročného genetického sekvenování.
Metoda je neinvazivní, šetří vzorek a umožňuje sledování metabolických změn během bioprocesů v reálném čase.

Budoucí trendy a možnosti využití

Vývoj pokročilých strojově učících se algoritmů zvýší citlivost a selektivitu rozlišení mikrobiálních komunit.
Integrace s mikrofluidikou a automatizovanými platformami umožní vysokopropustnou fenotypovou charakterizaci.
Kombinace Ramanovy spektroskopie s dalšími spektroskopickými a zobrazovacími technikami otevře nové aplikační možnosti v diagnostice a výzkumu.

Závěr

Ramanova spektroskopie představuje efektivní a rychlou metodu pro fenotypickou identifikaci bakterií na pevných médiích.
Volba vlnové délky ovlivňuje poměr signál/šum a úroveň autofluorescence, přičemž kombinace obou přístupů poskytuje flexibilní analýzu.
Pro detailní rozlišení komplexních mikrobiálních směsí je doporučena implementace strojového učení.

Reference

• Paret M.L.; Sharma S.K.; Green L.M. a kol. Biochemical Characterization of Gram-Positive and Gram-Negative Plant-Associated Bacteria with Micro-Raman Spectroscopy. Appl Spectrosc. 2010;64(4):433–441.