Analýza je určena k identifikaci a stanovení množství a čistoty fragmentu rekombinantního lidského růstového hormonu rHGH 176–191 a peptidu AOD-9604. Kombinuje metody LC-MS, CHNS a HPLC, které poskytují informace o identitě peptidu, jeho čistém obsahu, peptidové čistotě a případné kontaminaci jinými peptidy nebo degradačními produkty.
Metoda umožňuje detekovat a stanovit obě cílové látky. Není proto nutné předem přesně vědět, zda vzorek obsahuje fragment rHGH 176–191, nebo AOD-9604.
Fragment rHGH 176–191
Fragment rHGH 176–191, označovaný také jako somatropin 176–191, je peptid odpovídající aminokyselinám 176 až 191 lidského růstového hormonu. Skládá se ze 16 aminokyselin a představuje C-koncovou část molekuly HGH.
Jeho molekulová hmotnost je přibližně 1 799 Da. Od AOD-9604 se liší první aminokyselinou v sekvenci.
AOD-9604
AOD-9604 je synteticky modifikovaný peptid odvozený od fragmentu lidského růstového hormonu 176–191. Stejně jako fragment rHGH obsahuje 16 aminokyselin, avšak na začátku sekvence obsahuje tyrosin namísto fenylalaninu.
Tento strukturní rozdíl umožňuje oba peptidy rozlišit pomocí LC-MS. Molekulová hmotnost AOD-9604 je přibližně 1 815 Da.
Použité analytické metody
LC-MS – identifikace a screening kontaminace
LC-MS se používá k potvrzení identity analyzovaného peptidu. Zároveň poskytuje screening přítomnosti jiných peptidů a degradačních produktů, které lze danou metodou detekovat.
CHNS – stanovení čistého obsahu peptidu
Elementární analýza CHNS stanovuje obsah uhlíku, vodíku, dusíku a síry ve vzorku. Na základě naměřených hodnot lze vypočítat čistý obsah peptidu neboli Net Peptide Content.
Protože je vzorek při CHNS analýze spalován, výsledek není ovlivněn problémy s rozpustností, které mohou komplikovat stanovení množství pomocí kapalinové chromatografie.
HPLC – stanovení peptidové čistoty
HPLC se používá ke stanovení peptidové čistoty a relativního zastoupení hlavní peptidové složky vůči chromatograficky detekovatelným nečistotám.
Co analýza stanovuje
- Identitu fragmentu rHGH 176–191 nebo AOD-9604
- Množství peptidu ve vzorku
- Čistý obsah peptidu pomocí CHNS
- Peptidovou čistotu pomocí HPLC
- Přítomnost jiných peptidů nebo degradačních produktů pomocí LC-MS
- Rozlišení mezi fragmentem rHGH 176–191 a AOD-9604
Parametry analýzy
- Cílové látky: fragment rHGH – somatropin 176–191 a AOD-9604
- CAS číslo AOD-9604: 221231-10-3
- Molekulová hmotnost AOD-9604: 1 815 Da
- Sekvence AOD-9604: H-Tyr-Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Cys(1)-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys(1)-Gly-Phe-OH
- CAS číslo fragmentu rHGH: 66004-57-7
- Molekulová hmotnost fragmentu rHGH: 1 799 Da
- Sekvence fragmentu rHGH: H-Phe-Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Cys(1)-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys(1)-Gly-Phe-OH
- Metoda identifikace: LC-MS
- Metoda stanovení množství: CHNS
- Metoda stanovení peptidové čistoty: HPLC
- Mez detekce: méně než 1/20 obvyklé dávky v lahvičce
- Výsledný formát pro lyofilizovaný vzorek: mg/lahvičku a peptidová čistota
- Alternativní výsledný formát: čistota m/m a peptidová čistota
- Minimální množství lyofilizovaného vzorku: 1 celá neotevřená lahvička s lyofilizátem
- Minimální množství API ve formě prášku: 30 mg v uzavřené skleněné lahvičce, která chrání vzorek před absorpcí vlhkosti
- Průměrná doba zpracování: 7 pracovních dnů
Důležité upozornění
Alternativní výsledný formát vyjádřený jako čistota m/m je určen pouze pro surové API ve formě prášku. U lyofilizovaných vzorků se standardně uvádí množství peptidu v mg/lahvičku a peptidová čistota.
Doplňkové analýzy
Analýza TFA
- Detekce a stanovení množství kyseliny trifluoroctové (TFA) ve vzorku. Výsledek je uváděn v mg/lahvičku.
Kompletní nezpracovaná data
- Poskytnutí dostupných nezpracovaných analytických dat z hlavního testu i ze všech objednaných doplňkových analýz, pokud jsou pro danou metodu k dispozici.
Analýza přítomnosti fentanylu
Alternativní výsledný formát – čistota m/m
- Alternativní vyjádření výsledku jako hmotnostní čistota m/m. Tato možnost je určena výhradně pro surové API ve formě prášku.
Test variability
Analýza více kusů vzorku za účelem posouzení variability v rámci jedné šarže. Všechny dodané vzorky musí pocházet ze stejné šarže stejného produktu.
Měření pH
Analýza endotoxinů
- Stanovení přítomnosti bakteriálních endotoxinů, zejména lipopolysacharidů (LPS). Test je dostupný pouze pro hotové produkty a není určen pro surové práškové vzorky.
- Standardní test poskytuje přesné výsledky do 10 EU/lahvičku. Vyšší hodnoty jsou odhadované a pro jejich přesné stanovení je nutné další měření s upraveným ředěním. Doporučuje se proto zaslat dvě lahvičky.
- Pokud je předem očekávána hodnota vyšší než 10 EU/lahvičku, lze metodu od začátku přizpůsobit vyššímu rozsahu.
Dodatečný protokol
- Vystavení samostatného dodatečného protokolu s jiným jménem klienta.
Testování sterility
- Testy TAMC a TYMC kontrolují přítomnost bakterií, kvasinek a plísní v produktu. Pro analýzu je nutné zaslat další neotevřené kusy vzorku. Průměrná doba zpracování testu je 14 dnů.
Analýza těžkých kovů
- Stanovení přítomnosti arsenu, kadmia, olova a rtuti ve vzorku. Analýzu dalších kovů lze řešit individuálně.
