Příprava lipozomů s pomocí ultrazvuku: Metodika, výhody a aplikace

Lipozomy jsou sférické vezikuly složené z lipidových dvojvrstev a jsou často používány ve farmaceutickém, kosmetickém a potravinář ském průmyslu pro svoji biokompatibilitu a schopnost zapouzdřit jak hydrofilní, tak i hydrofobní látky. Použití ultrazvuku s vysokou intenzitou k zapouzdření lipozomů je jedním z nejvíce používaných výrobních postupů především pro jeho účinnost, stabilitu a schopnost vytvářet lipozomy s řízenou velikostí částic a vysokou mírou zapouzdření. Výhodou tohoto postupu je také škálovatelnost. tj. možnost na základě laboratorních měření lineárně přenést tyto výsledky do průmyslové praxe. Tento článek seznamuje s metodou tvorby lipozomů za pomocí ultrazvuku, jejich výhodami a různými aplikacemi v přípravě léčiv, terapeutik a potravních doplňků.

Sonikace pro přípravu lipozomů

Typ sonotrody je zásadním nástrojem pro přípravu lipozomů s účinnou látkou. Zde je přehled pro přípravu zapouzdřených lipozomů s pomocí ultrazvuku.

1) Příprava lipidového roztoku

Proces začíná přípravou lipidového roztoku. Mezi běžně používané lipidy patří fosfatidylcholin, cholesterol a další fosfolipidy. Tyto lipidy jsou rozpuštěny v organických rozpouštědlech, jako je etanol nebo chloroform.

2) Příprava lipidového filmu

Lipidový roztok odpaříme v rotační vakuové odparce. Dojde tak k odpaření organického rozpouštědla a vytvoření tenkého suchého lipidového filmu na stěnách baňky s kulatým dnem.

3) Hydratace lipidového filmu

Vysušený lipidový film se hydratuje vodným roztokem, který může obsahovat účinnou látku, která má být zapouzdřena. Tento krok vede k tvorbě multilamelárních vezikul (MLV). Proces hydratace většinou probíhá ve vortexu a nebo při jiném mírném míchání, a to nad teplotou lipidového přechodu.

4) Sonikace 

Multilamelární vezikuly (MLV) jsou podrobeny sonikaci s příslušnou sonotrodou za vzniku kavitace. Tento postup způsobí sonoporaci, a tak jsou jsou lipozomy účinně nasyceny, což vede k vysoké účinnosti zachycení (EE%). Zvýšená propustnost zapříčiněná sonoporací usnadňuje difuzi enkapsulačních látek do lipozomů. Když proces sonikace zastavíme, lipidové dvojvrstvy se znovu rychle uspořádají a zachytí uvnitř enkapsulované látky. Sonikace navíc rozkládá (MLV) na menší unilamelární vezikuly (ULV) nebo malé unilamelární vezikuly (SUV) s velikostí typicky v rozsahu od 20 do 200 nm. Parametry, jako je doba sonikace, výkon a teplota, jsou optimalizovány pro dosažení požadované velikosti lipozomů a účinnosti enkapsulace.

5) Purifikace a charakterizace

Po sonikaci se suspence liposomů často filtruje nebo centrifuguje pro odstranění větších vezikul a také nezapouzdřeného materiálu. Výsledné lipozomy jsou charakterizovány s pomocí technik, jako je dynamický rozptyl světla (DLS) pro distribuci velikosti částic, Zeta potenciál a transmisní elektronová mikroskopie (TEM) pro morfologii. 

Příklady testů

Sonikátory se sonotrodou byly rychle přijaty jako spolehlivá technika pro přípravu lipozomů jak ve výzkumu, tak i v průmyslové praxi. Efektivita procesu tvorby lipozomů s pomocí ultrazvuku i při užití různých účinných látek byla prokázána ve výzkumných studiích pro mnoho receptur. Níže jsou uvedeny dva krátké přehledy užití lipozomální enkapsulace s použitím sonikátoru se sonotrodou.

Hadian a kol. [1] zkoumal účinnost sonikace na zapouzdření omega-3 mastné kyseliny z rybího oleje (DHA, EPA) v lipozomech. Aby bylo možné vyhodnotit účinnost a kvalitu zachycení, porovnávali metodu přípravy lipozomů s pomocí ultrazvuku s metodou extruze lipozomů. 

Bylo zjištěno, že s pomocí sonikace za užití sonikátoru Hielscher UP 200St (stojanový sonikátor opatřený sonotrodou) je významně usnadněn průnik DHA, EPA do nanoliposomální membrány. Lipozomy připravené sonikací měly také kulovitý tvar a vysokou strukturální integritu.

Pragolab: Obr. 1: Průmyslové zařízení se sonikátorem UP 2000 hdT

Paini a kol. [2] vyvinuli jednoduchou, ale vysoce účinnou metodu využívající sonikace pro přípravu lipozomů s obsahem apigeninu a s řepkovým lecitinem potravinářské kvality. Médiem je voda, ne organická rozpouštědla. K sonikaci byl použit sonikátor UP 400St s příslušnou sonotrodou, účinnost zapouzdření přes 92 %. Velikost lipozomů lze přesně řídit amplitudou sonotrody a dobou sonikace. Analýzy potvrdily, že lipozomální apigeninové struktury mají vysoký Zeta potenciál, dobrý index polydisperzity a stabilní zapouzdření.

Pragolab: Obr. 2: Sonikátor UP 400St s průtočnou sondou FC22K

Výhody ultrazvukové lipozomální enkapsulace

Techniky přípravy lipozomů se samozřejmě liší, každá má svůj vlastní soubor výhod a omezení. Lipozomy připravené s pomocí ultrazvuku mají několik výhod: velmi vysokou účinnost zachycení ( EE%), vynikající kontrolu velikosti lipozomů, spolehlivost procesu, pokud jde o jeho reprodukovatelnost, stejně tak, jako o lineární škálovatelnost na větší objemy.

1) Zvýšená účinnost zapouzdření

Ultrazvuk nabízí vysokou účinnost zapouzdření pro hydrofilní i hydrofobní látky. Intenzivní smykové síly a kavitace usnadňují rovnoměrné rozložení zapouzdřující látky uvnitř lipozomální dvojvrstvy nebo vodného jádra.

2) Kontrolovaná distribuce velikosti

Možnost přesně řídit parametry sonikace umožňuje produkci lipozomů s úzkými distribucemi velikosti částic, nezbytnými pro konzistentní dodávání účinné látky a její biologickou dostupnost.

3) Škálovatelnost a reprodukovatelnost

Tvorba lipozomů s pomocí ultrazvuku je výborně škálovatelná, takže je vhodná jak v laboratorním měřítku, tak i v průmyslové praxi. Reprodukovatelnost procesu zajišťuje kvalitu napříč šaržemi.

4) Minimální použití organických rozpouštědel

Ve srovnání s jinými metodami přípravy lipozomů vyžaduje tato metoda s pomocí ultrazvuku výrazně méně organických rozpouštědel. Je tak snížena potenciální toxicita a dopad na životní prostředí.

5) Všestrannost

Tato technika je až univerzální, pojme široké spektrum lipidů a enkapsulačních látek, tedy je možné použít ji v různých průmyslových odvětvích.

Aplikace v potravinářském a farmaceutickém průmyslu

Ultrazvukové sonikátory fy. Hielscher se užívají jak ve výzkumných laboratořích, tak i v průmyslové praxi pro výrobu lipozomů v potravinářské a farmaceutické kvalitě. Lipozomy připravené s pomocí ultrazvuku nabízejí vysokou biologickou dostupnost, mohou obsahovat hodně aktivních látek a jsou stabilní. Sonikace též vede k uniformní distribuci velikosti částic. Splněním všech těchto kvalitativních kritérií jsou lipozomy připravené s pomocí ultrazvuku skvělým nosičem pro účinné látky, farmaceutické přísady (API), fotochemikálie, doplňky stravy, funkční potraviny i kosmetiku.

1) Potravní doplňky

Ultrazvuková lipozomální enkapsulace se užívá ke zvýšení biologické dostupnosti potravních doplňků. Bylinné extrakty, vitamíny, minerály zapouzdřené v lipozomech vykazují vyšší absorpci a stabilitu, což vede k lepší účinnosti. Například lipozomální vitamín C a kurkuminové doplňky jsou oblíbené pro své terapeutické benefity.

2) Léčiva

Ve farmaceutickém průmyslu slouží lipozomy jako nosiče účinné látky, je zlepšena jejich rozpustnost, stabilita a zacílení. Receptury s lipozomy připravenými s pomocí ultrazvuku se používají při podávání chemoterapeutik, antibiotik a též vakcín. Lipozomální doxorubicín například snižuje kardiotoxicitu spojenou s konvenční terapií doxorubicínem.

3) Terapeutika

Terapeutika těží z lipozomální enkapsulace tím, že dosahují řízeného uvolňování a cíleného doručení účinné látky. Lipozomy mohou procházet biologickými bariérami, jako je hematoencefalická bariéra, 

a umožňují tak dodávání léků do specifických tkání nebo buněk. S pomocí ultrazvuku vyrobené nanolipozomy mají vysokou biologickou dostupnost, protože jejich nanovelikost jim umožňuje prostupovat cíleně do buněk a tkání. Tato vlastnost je zvláště výhodná při léčbě neurologických poruch a karcinomu.

4) Funkční potraviny

Lipozomy užité pro výrobu funkčních potravin v potravinářském průmyslu zlepšují dodávání bioaktivních látek, jako jsou omega-3 mastné kyseliny, probiotika a antioxidanty. Tyto zapouzdřené bioaktivní látky vykazují zlepšenou stabilitu a biologickou dostupnost, což přispívá k lepším zdravotním výsledkům. Například ultrazvukově asistovaná lipozomální enkapsulace polyfenolů v nápojích pomáhá zachovat jejich antioxidační vlastnosti.

5) Kosmetika

Receptury kosmetických produktů, označované také jako kosmeceutika, využívají lipozonů, které zvyšují účinnost aktivních látek proti stárnutí (anti – aging), např. antioxidantů, a zvyšují ochranu proti oxidativnímu stresu. Dvouvrstvá struktura lipozomů chrání citlivé sloučeniny, např. antioxidanty, před vlivem okolního prostředí, jako je UV záření a znečištění ovzduší, a tak je pomáhá chránit před jejich degradací. Vylepšení zapouzdření aktivních látek v lipozomech připravených s pomocí ultrazvuku umožňuje užít v receptuturách těkavé a citlivé látky, jejichž užití by bylo jinak velice náročné. Tvorba lipozomů s pomocí ultrazvuku je robustní a všestranná technika, která má významné výhody především v oblasti účinnosti zapouzdření, kontroly velikosti částic, škálovatelnosti a také v šetrném působení na životní prostředí. Použití této techniky zahrnuje různá průmyslová odvětví od zvyšování biologické dostupnosti aktivních látek v potravních doplňcích až po zlepšování dodávání a účinnosti v léčivech a terapeutikách. Výzkum a pokrok v technologiích přinášejí potenciál pro ultrazvukovou lipozomální enkapsulaci a umožňují tak inovovat a vylepšovat složení produktů pro zdraví, medicínu, výživu a kosmetiku.

Nanonosiče připravené sonikací

Kromě lipozomů se sonikace užívá pro přípravu jiných forem nanonosičů, jako jsou pevné lipidové nanonosiče, nanostrukturované lipidové nosiče a také nanoemulze. Sonikátory firmy Hielscher Ultrasound GmbH jsou známé pro své užití moderních a pokrokových technologií. Umožňují tvorbu těchto nových nanonosičů a jejich celosvětové užití v potravinářském, farmaceutickém a kosmetickém průmyslu.

Více informací: https://www.hielscher.com/liposomes