Analýza rtuti v mořských plodech pomocí LC-ICP-MS a zavedení funkce automatického ředění u autosampleru

Uživatelské výhody

• Analýza rtuti v mořských plodech pomocí systému LC-ICP-MS může být provedena přesně.
• Použití metodického balíčku pro analýzu různých forem rtuti eliminuje nutnost registrace analytických podmínek atd.
• Funkce automatického ředění autosampleru eliminuje jakýkoli ruční proces ředění, čímž šetří čas a námahu.

Rtuť má tendenci se hromadit v potravním řetězci a některé potraviny, jako jsou mořské plody, mohou obsahovat vysoké hladiny rtuti. Rtuť však existuje v různých formách a její toxicita se liší v závislosti na formě. Obecně je methylrtuť toxičtější než anorganická rtuť a jiné organické sloučeniny rtuti. Hodnocení toxicity v potravinách vyžaduje nejen analýzu celkového obsahu rtuti, ale také analýzu formy rtuti. LC-ICP-MS, která separuje rtuť podle jejích forem pomocí HPLC a detekuje rtuť s vysokou citlivostí pomocí ICP-MS, je analytická metoda vhodná pro analýzu různých forem rtuti. 

V této aplikační novince byla provedena analýza forem methylrtuti a celkové rtuti v mořských plodech pomocí systému LC-ICP-MS, který spojil ICPMS-2040/2050 s Nexera XS inert. Dále jsme také vyhodnotili funkci automatického ředění autosampleru řady Nexera pro analýzu různých forem rtuti.

Příprava vzorku

Jako vzorek byly použity komerčně dostupné mořské plody z tuňáka. Předúprava byla provedena podle příručky Elemental Analysis Manual (EAM) 4.8¹ amerického Úřadu pro kontrolu potravin a léčiv (FDA). 

(1) Odvažte přibližně 0,25 g jedlé části mořských plodů z tuňáka. Vzorek se homogenizuje po dobu 30 sekund pomocí zařízení na drcení kuliček, aby se zlepšila účinnost extrakce. (V tomto okamžiku se do vzorku přidá standardní roztok rtuti pro test výtěžnosti.) 

(2) Do extrakčních vialek se přidá 25 ml extrakčního roztoku (vodný 1% (w/v) Lcysteine•HCl•H2O), vialky se pevně uzavřou a ručně se důkladně protřepou

(3) Extrakční vialky zahřejte na 120 minut ve vodní lázni o teplotě 60 °C. Po 60 minutách zahřívání a znovu po 120 minutách každou vialku důkladně protřepejte rukou. 

(4) Extrakční vialky vyjměte z vodní lázně a nechte vychladnout na pokojovou teplotu. 

(5) Část extraktu přefiltrujte přes filtr 0,45 μm přímo do autosamplerové HPLC vialky

Kalibrační standardy a mobilní fáze

Ředící roztok

Ředící roztok pro standardy byl připraveno smícháním 1% (w/v) L-cysteinu•HCl•H₂O s 8% (v/v) metanolem.

Základní standardní roztok

1 mg/l roztok anorganické rtuti byl připraven zředěním 1000 mg/l anorganické rtuti (komerčně dostupná) vodným 1% (w/v) roztokem L-cysteinu•HCl•H₂O. Roztok 1 mg/l alkylrtuti byl připraven zředěním 2 standardních roztoků směsi alkylrtuti (každý 10 mg/l pro methylrtuť a ethylrtuť v toluenovém roztoku) (komerčně dostupný) metanolem. Roztok 1 mg/l anorganické rtuti a roztok 1 mg/l alkylrtuti byly smíchány a zředěny tak, aby každý měl koncentraci 50 µg/l.

Kalibrační standardy

Kalibrační standardy byly připraveny zředěním zásobního standardního roztoku. Koncentrace každé formy rtuti v kalibračním standardu je 0,5 až 20 µg/l.

Vnitřní standardní roztok

Vnitřní standardní roztok byl připraven zředěním komerčně dostupného standardního roztoku Tl 1 % (v/v) HNO₃. Koncentrace Tl ve vnitřním standardním roztoku byla 100 µg/l. 

Mobilní fáze

Methanol a 0,01 mol/l roztok octanu amonného (obsahující 0,12 % L-cysteinu s roztokem amoniaku upraveným na pH 7,5) (8 : 92)

Konfigurace přístroje a analytické podmínky

Vzorky byly analyzovány pomocí systému LC-ICP-MS, který se skládal z přístroje ICPMS-2040/2050 připojeného k Nexera XS inert (obr. 1). Software LabSolutions ICPMS TRM umožňuje ovládat systém ICPMS-2040/2050 a jednotky Shimadzu LC. Díky tomu lze pomocí jediného softwarového programu provádět vše od nástřiku vzorků až po analýzu chromatogramů. Pro analýzu byly použity analytické podmínky uvedené v balíčku metod LC-ICPMS pro analýzu forem rtuti. 

Shimadzu: Obr. 1 Systém LC-ICP-MS

Analytické podmínky HPLC

• Systém: Nexera XS inert 
• Kolona*1: Shim-pack Scepter C18-120 [kolona bez obsahu kovů] (150 mm × 4,6 mm I.D., 5 µm) 
• Eluent: 0,01 mol/L octan amonný (pH 7,5): methanol = 92: 8 Průtok: 1 ml/min
• Teplota kolony: 40 °C 
• Nastřikovaný objem: 50 µl 
• Proplachovací roztok: voda 
• Vialka*2: Shimadzu Vial, LC, 1,5 ml, polypropylen

Analytické podmínky ICP-MS

• Přístroj: ICPMS-2040/2050 
• Rozprašovač: Rozprašovač DC04 
• Hořák: Minihořák 
• Komora: Cyklónová komora (elektronicky chlazená) 
• Odběrný kužel: niklový skimmer 
• Kónus: nikl 
• RF výkon: 1,20 kW 
• Hloubka odběru vzorků: 7,0 mm 
• Průtok plazmového plynu: 9,0 l/min 
• Průtok pomocného plynu: 1,10 l/min 
• Průtok nosného plynu: 0,85 l/min 
• Průtok ředicího plynu: 0 l/min 
• Kolizní plyn: He
• Průtok kolizního plynu: 6,0 ml/min 
• Napětí cely: -25 V 
• Energetický filtr: 7 V

Analýza kalibračních standardů

Obr. 2 ukazuje chromatogram anorganické rtuti, methylrtuti a ethylrtuti, každý v koncentraci 0,5 µg/l. 

Shimadzu: Obr. 2 Chromatogram 0,5 µg/l rtuti

Anorganická rtuť, methylrtuť a ethylrtuť byly úspěšně separovány a detekovány. Kalibrační křivky jsou znázorněny na obr. 3. 

Shimadzu: Obr. 3 Kalibrační křivky rtuti

Byla získána dobrá linearita s korelačním koeficientem přes 0,999. Kalibrační standard 0,2 µg/l byl analyzován 10krát, aby se vypočítala dolní mez detekce (LOD). LOD každé složky je uvedena v tabulce 3. Vzorec je následující: LOD (3σ) = 3 x (standardní odchylka z 10 měření roztoku 0,2 µg/l) x sklon kalibrační křivky.

Shimadzu: Tab. 3 Korelační koeficient a LOD rtuti

Analýza forem rtuti v mořských plodech

Obr. 4. ukazuje chromatogram extrakce mořských plodů (tuňáka). Analýza forem methylrtuti a celkové rtuti v mořských plodech byla provedena podle FDA EAM 4.8. 

Shimadzu: Obr. 4 Chromatogram extrakce mořských plodů

Celková rtuť byla tedy vypočítána jako součet koncentrací anorganické rtuti a methylrtuti. Výsledky analýzy mořských plodů a testů obnovy spike jsou uvedeny v tabulce 4. U každé složky byla dosažena dobrá obnova (methylrtuť 102 %, celková rtuť 105 %).

Shimadzu: Tabulka 4 Výsledky z analýzy mořských plodů

Příprava kalibračních standardů pomocí funkce automatického ředění

Pro analýzu vzorků pomocí LC-ICP-MS je běžné nejprve vytvořit kalibrační křivku pomocí standardního vzorku a provést kvantifikaci. Příprava kalibračních standardů ředěním standardních roztoků je však časově náročná. V posledních letech se stále více prosazuje automatizovaná příprava, která zvyšuje efektivitu práce a produktivitu. 

Autosampler Nexera XS je vybaven funkcí automatického ředění. Podmínky pro ředicí faktory a míchání lze nastavit pomocí softwaru LabSolutions ICPMS TRM. Příklad stojanu autosampleru je uveden na obr. 5 a okno nastavení programu předúpravy autosampleru je uvedeno na obr. 6. Objem odpovídající ředicímu poměru se odsaje z lahvičky obsahující zásobní roztok rtuti (zelená) a spolu s ředidlem se rozdělí do prázdné míchací lahvičky (oranžová), která byla předem nastavena v autosampleru (konečný objem je v tomto příkladu 100 μl). 

Shimadzu: Obr. 5 Příklad stojanu autosampleru (vialka se zásobním roztokem - číslo zásobníku 1, číslo vialky 54)

Shimadzu: Obr. 6 Nastavení programu předúpravy autosampleru

Některé příkazy programu předúpravy jsou uvedeny v tabulce 5. Chcete-li přizpůsobit polohu vialky nebo ředicí faktor, upravte příkazy zvýrazněné modře v tabulce 5. 

Shimadzu: Tabulka 5 Program předúpravy

Kalibrační standardy od 0,5 µg/l do 20 µg/l byly automaticky připraveny pomocí této funkce. Konfigurace a analytické podmínky pro HPLC při použití funkce automatického ředění viz níže:

• Systém: Nexera XS inert 
• Kolona*1: Shim-pack Scepter C18-120 [kolona bez obsahu kovů] (150 mm × 4,6 mm I.D., 5 µm) 
• Eluent: 0,01 mol/L octan amonný (pH 7,5): methanol = 92: 8 
• Průtok eluentu: 1 ml/min 
• Teplota kolony: 40 °C 
• Nastřikovaný objem: 50 µl 
• Zdvih jehly: 45 mm 
• Proplachovací roztok (R0): ředící roztok (1 % (w/v) L-cystein•HCl•H2O s 8 % (v/v) methanolu) 
• Směšovací vialka*2: Shimadzu Vial, LC, 1 ml, 
• Polypropylenová vialka pro zásobní roztok*3: Shimadzu Vial, LC, 1,5 ml

Vyhodnocení kalibračních křivek vytvořených automatickou funkcí ředění

Byly vyhodnoceny kalibrační křivky vytvořené pomocí automatické funkce ředění. Pro potvrzení přesnosti byl ručně připraven kalibrační standard obsahující 1 µg/l anorganické rtuti, methylrtuti a ethylrtuti a kvantifikován pomocí kalibrační křivky vytvořené automatickou funkcí ředění. Dále byla automatická funkce ředění použita k přípravě standardu 1 µg/l šestkrát za účelem potvrzení přesnosti. Korelační koeficienty kalibrační křivky a výsledky přesnosti a opakovatelnosti jsou uvedeny na obr. 7 a v tabulce 7.

Shimadzu: Obr. 7 Kalibrační křivky rtuti pomocí funkce automatického ředění

Shimadzu: Tabulka 7 Hodnocení funkce automatického ředění

Závěr

V této aplikační novince byla provedena analýza forem methylrtuti a celkové rtuti v mořských plodech pomocí systému LC-ICP-MS, který spojil ICPMS-2040/2050 s Nexera XS inert podle podmínek uvedených v „LC-ICP-MS Method Package for Mercury Speciation Analysis“ (Balíček metod LC-ICP-MS pro speciální analýzu rtuti).

Separace anorganické rtuti, methylrtuti a ethylrtuti byla potvrzena analýzou kalibračních standardů. Dále byla provedena analýza methylrtuti a celkové rtuti v mořských plodech. Dobrá výtěžnost spikeů naznačila, že analýza methylrtuti a celkové rtuti v mořských plodech může být pomocí tohoto systému provedena přesně. K vytvoření kalibračních křivek pro jednotlivé druhy rtuti byla použita funkce automatického ředění automatického vzorkovače Nexera XS inert. Ve validačním testu byly výsledky přesnosti i správnosti dobré. Tato funkce zjednodušuje přípravu kalibračních standardů.