Simultaneous quantification of peptides and phosphopeptides by capLC-ICP-MS using the Agilent 8800/8900 Triple Quadrupole ICP-MS

Význam tématu

Precizní kvantifikace fosforu a síry v peptidových směsích je klíčová pro pochopení biologických procesů v proteomice, farmaceutickém výzkumu a klinických aplikacích. Tradiční LC-MS/MS metody vyžadují izotopově značené standardy, zatímco LC-ICP-MS poskytuje nespecifickou absolutní kvantifikaci heteroatomů pomocí jednoho obecného standardu.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout a ověřit postup simultánního stanovení peptidů a fosfopeptidů pomocí kapilární LC spojené s triple-kvadrupólovým ICP-MS (Agilent 8800/8900) v režimu MS/MS mass shift. Studie porovnala detekční limity, linearitu a účinnost odstraňování interferencí u síry (S) a fosforu (P).

Použitá metodika a instrumentace

Chromatografie:

• Agilent 1200 capLC, Zorbax SB C18 (150×0,3 mm, 5 µm)
• Mobilní fáze A: voda/0,1 % HCOOH/10 ng/mL Ge, B: acetonitril/0,1 % HCOOH
• Gradient: 0–3 min 1 % B, 3–35 min lineárně 1→60 % B, 5 µL/min, injekce 1–2 µL

ICP-MS:

• Agilent 8800 Triple Quadrupole ICP-MS (MS/MS mass shift)
• Q1 filtruje m/z 32 (S) a 31 (P), ORS cell s O₂, Q2 detekuje 48SO⁺ a 47PO⁺
• O₂ v buněčném plynulém režimu (0,35 mL/min), Ar:O₂ (8:2) v nebulizátoru
• Integrace: 150 ms, průtok 5 µL/min

Standardy:

• BNPP (fosfor), methionin (síra) 0–200 ng/mL
• Peptidy: LRRApSLG, KRSpYEEHIP, ACTPERMAE, VPMLK

Hlavní výsledky a diskuse

Studie prokázala:

• Výjimečná linearita (R²>0,999) a opakovatelnost (RSD<4 %).
• Detekční limity: 6,6 fmol P (0,10 ng/mL), 11 fmol S (0,18 ng/mL) – nejnižší dosud v LC-ICP-MS.
• Účinné odstranění interferencí potvrzené shodou poměru ³⁴S/³²S s teoretickou hodnotou.
• Široké peaky se zachovanou izotopovou distribucí, umožňující přesnou kvantifikaci i v organickém gradientu.

Přínosy a praktické využití metody

Tento přístup nabízí:

• Nespecifickou absolutní kvantifikaci peptidů a fosfopeptidů bez drahých izotopových standardů.
• Vysokou citlivost a selektivitu díky tandemovému MS a mass shift taktice.
• Široké uplatnění v proteomice, farmaceutickém vývoji, QA/QC a stanovování metabolitů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj směřuje k využití Agilent 8900 s optimalizovanou cestou argonu pro ještě nižší pozadí S a P, automatizované kvantifikaci s gradientní kompenzací a rozšíření do environmentální analýzy a charakterizace nanočástic.

Závěr

Triple kvadrupólový capLC-ICP-MS v MS/MS mass shift režimu výrazně zlepšuje citlivost a selektivitu stanovení S a P v peptidových směsích. Metoda přináší nejnižší detekční limity a univerzální přístup k absolutní kvantifikaci bez nutnosti izotopových standardů.

Reference

• 1. Pereira Navaza A.; Ruiz Encinar J.; Sanz-Medel A. Angew. Chem. Int. Ed. 2007, 46, 569–671.
• 2. Pröfrock D.; Leonhard P.; Prange A. J. Anal. At. Spectrom. 2003, 18, 708–713.
• 3. Pröfrock D.; Leonhard P.; Ruck W.; Prange A. Anal. Bioanal. Chem. 2005, 381, 194–204.
• 4. Smith C.J.; Wilson I.D.; Weidolf L.; Abou-Shakra F.; Thomsen M. Chromatographia 2004, 59, S165–S170.
• 5. Wind M.; Edler M.; Jakubowski N.; Linscheid M.; Wesch H.; Lehmann W.D. Anal. Chem. 2001, 73, 29–35.
• 6. Schaumlöffel D.; Giusti P.; Preud’Homme H.; Szpunar J.; Lobinski R. Anal. Chem. 2007, 79, 2859–2868.
• 7. Pröfrock D.; Leonhard P.; Prange A. Anal. Bioanal. Chem. 2003, 377, 132–139.
• 8. Hann S.; Koellensperger G.; Obinger C.; Furtmüller P.G.; Stingeder G. J. Anal. At. Spectrom. 2004, 19, 74–79.
• 9. Stürup S.; Bendahl L.; Gammelgaard B. J. Anal. At. Spectrom. 2006, 21, 201–203.
• 10. Zinn N.; Hahn B.; Pipkorn R.; Schwarzer D.; Lehmann W.D. J. Proteome Res. 2009, 8, 4870–4875.
• 11. Hann S.; Koellensperger G.; Obinger C.; Furtmüller P.G.; Stingeder G. J. Anal. At. Spectrom. 2004, 19, 74–79.
• 12. Zinn N.; Krüger R.; Leonhard P.; Bettmer J. Anal. Bioanal. Chem. 2008, 391, 537–543.
• 13. Wind M.; Wegener A.; Eisenmenger A.; Kelner R.; Lehmann W.D. Angew. Chem. Int. Ed. 2003, 42, 3425–3427.
• 14. Clough R.; Evans P.; Catterick T.; Evans E.H. Anal. Chem. 2006, 78, 6126–6132.
• 15. Becker J.S. J. Anal. At. Spectrom. 2002, 17, 1172–1185.
• 16. Mason P.R.D.; Košler J.; de Hoog J.C.M.; Sylvester P.J.; Meffan-Main S. Anal. At. Spectrom. 2006, 21, 177–186.