Absolute Quantification of Proteins in Snake Venom

Význam tématu

Odborná analýza jedů hadů poskytuje cenné informace pro vývoj účinné protijedové terapie a potenciální farmaceutické aplikace. Množství a identita toxinů v jedu ovlivňují klinické projevy uštknutí a otevírají prostor pro objev nových biologicky aktivních sloučenin.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo vyvinout a ukázat metodiku absolutní kvantifikace intactních proteinů z jedu spitting kobry Naja mossambica za využití kapilární kapalné chromatografie spojené s ICP-QQQ v režimu MS/MS a online izotopové ředění (IDA). Studie zahrnovala validaci metody na proteinech referenčních standardů a její aplikaci na komplexní vzorek hadího jedu.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda byla založena na:

• Kapilární LC separaci na Bioshell A400 C4 kolonce (3,4 μm, 150×0,3 mm) při teplotě 80 °C a průtoku 3,5–4,5 μL/min
• Post-kolonové přidávání obohaceného izotopu 34S a interního standardu BOC-Met-OH
• ICP-QQQ (Agilent 8800) v MS/MS režimu s kyslíkovou cell gas pro odstranění spektroskopických interferencí a měřením SO+ produktů ze S izotopů

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda byla úspěšně validována na standardních proteinech, kde izotopová ředicí analýza poskytla shodu s deklarovanou čistotou (BSA 95 ± 5 %, mAb 77 ± 4 %) a externí kalibrace S potvrdila výsledky (96 ± 1 % a 79 ± 2 %). Při aplikaci na Naja mossambica venom se podařilo separovat a kvantifikovat 27 sírou obsahujících proteinových špiček. Hlavními rodinami byly trojprsté toxiny (3FTx) a fosfolipázy A2 (PLA2), jejichž koncentrace se pohybovaly v řádu jednotek až desítek μmol proteinu na gram jedu. Chromatografická obnova přesahovala 98 % pro všechny testované proteiny a byla 99 ± 1 % pro jed cobry.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje:

• Absolutní kvantifikaci intactních proteinů bez nutnosti proteinově specifických standardů
• Vysokou citlivost a selektivitu díky odstranění interferencí v MS/MS režimu
• Rychlou analýzu komplexních biologických vzorků, včetně jedů a dalších proteomických matric

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry dalšího rozvoje:

• Rozšíření na další heteroelementy a multiplexní kvantifikaci vícero prvků v proteinech
• Automatizace a zkrácení analýzy pro vysokopropustní proteomiku a QC laboratoře
• Integrace s molekulárně biologickými databázemi pro širší identifikaci neznámých proteinových složek

Závěr

Prezentovaná kombinace capLC-ICP-QQQ s online IDA síry představuje robustní a univerzální přístup pro absolutní kvantifikaci intactních proteinů v náročných proteomických vzorcích. Metoda nabízí vysokou přesnost, cita­vnost a umožňuje analýzu komplexních směsí bez nutnosti standardních proteinů.

Reference

1. Calderón-Celis F. et al. Elemental Mass Spectrometry for Absolute Intact Protein Quantification without Protein-Specific Standards: Application to Snake Venomics. Anal. Chem., 2016, 88(19):9699–9706.
2. De Raeve P., Bianga J. Fast and accurate absolute-quantification of proteins and antibodies using Isotope Dilution-Triple Quadrupole ICP-MS. Agilent 2016.
3. Wind M. et al. Angew. Chem. Int., 2003, 42:3425–3427.
4. Balcaen L. et al. J. Anal. At. Spectrom., 2013, 28:33–39.