Simultaneous Quantification of Peptides and Phosphopeptides by capLC-ICP-MS

Význam tématu

Quantitativní určení peptidů a fosfopeptidů je zásadní pro farmaceutický a biomedicínský výzkum i pro průmyslovou kontrolu kvality. Metoda založená na kapilární kapalinové chromatografii spojené s ICP-QQQ nabízí nezávislou, nekomenzulem specifickou analýzu heteroatomů (P, S) v biomolekulách, což rozšiřuje možnosti přesné absolutní kvantifikace bez nutnosti složitých izotopově značených standardů.

Cíle a přehled studie

Práce představuje aplikaci Agilent 8800/8900 Triple Quadrupole ICP-MS spojeného s kapilárním LC pro:

• simultánní měření fosfopeptidů a S-obsahujících peptidů
• stanovení nejnižších detekčních limitů (DL) pro P a S prostřednictvím MS/MS režimu s přesným odstraněním interferencí
• porovnání s dříve publikovanými metodami LC-ICP-MS

Použitá metodika a instrumentace

Metoda využívá Agilent 1200 capLC s kolonkou Zorbax SB C18 (150×0,3 mm, 5 μm), mobilní fáze voda/acetonitril s 0,1 % HCOOH a interním standardem Ge při 10 ng/mL. Eluce gradientem (1–60 % B) při průtoku 5 μL/min. ICP-QQQ operuje v MS/MS mass shift režimu:

• pro S: Q1 na m/z 32, reakce s O₂, Q2 na m/z 48 (SO⁺)
• pro P: Q1 na m/z 31, reakce s O₂, Q2 na m/z 47 (PO⁺)

Oxygen (Ar:O₂ 8:2) přidaný do nebulizéru a do buněčného plynu efektivně eliminuje polyatomické interferující ionty.

Hlavní výsledky a diskuse

Detekční limity stanovené v kapilární LC-ICP-QQQ dosáhly 6,6 fmol P (0,10 ng/mL) a 11 fmol S (0,18 ng/mL), což jsou rekordně nízké absolutní DL pro LC-ICP-MS. Kalibrační závislosti pro standardy BNPP a methionin byly vysoce lineární (RSD <4 %). Poměr izotopů ³⁴S/³²S odpovídal teoretické hodnotě, což potvrzuje kompletní odstranění interferencí.

Přínosy a praktické využití metody

Tento přístup umožňuje:

• absolutní kvantifikaci proteomických vzorků bez izotopových standardů
• simultánní měření fosforylace a obsahového stanovení S v peptidových směsích
• využití v farmacii, biotechnologiích, environmentální a potravinářské analýze

Budoucí trendy a možnosti využití

Přístroj Agilent 8900 s optimalizovanou cestou argonu slibuje další snížení pozadí pro S a Si, což povede k ještě nižším detekčním limitům. Potenciál má i aplikace izotopové ředící kalibrace pro korekci sensitivních změn a rozšíření metody na další prvky v proteinech.

Závěr

CapLC-ICP-QQQ představuje revoluční nástroj pro nekomenzuelně specifickou a vysoce citlivou absolutní kvantifikaci peptidů a fosfopeptidů. Eliminace interferencí v MS/MS režimu zajišťuje spolehlivé výsledky a otevírá dveře širokému uplatnění v základním i aplikovaném výzkumu.

Reference

1. Pereira Navaza, A. et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2007, 46, 569–671.
2. Pröfrock, D. et al. J. Anal. At. Spectrom. 2003, 18, 708–713.
3. Pröfrock, D. et al. Anal. Bioanal. Chem. 2005, 381, 194–204.
4. Smith, C. J. et al. Chromatographia. 2004, 59, S165–S170.
5. Wind, M. et al. Anal. Chem. 2001, 73, 29–35.
6. Schaumlöffel, D. et al. Anal. Chem. 2007, 79, 2859–2868.
7. Pröfrock, D. et al. Anal. Bioanal. Chem. 2003, 377, 132–139.
8. Hann, S. et al. J. Anal. At. Spectrom. 2004, 19, 74–79.
9. Stürup, S. et al. J. Anal. At. Spectrom. 2006, 21, 201–203.
10. Zinn, N. et al. J. Proteome Res. 2009, 8, 4870–4875.
11. Hann, S. et al. J. Anal. At. Spectrom. 2004, 19, 74–79.
12. Zinn, N. et al. Anal. Bioanal. Chem. 2008, 391, 537–543.
13. Wind, M. et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2003, 42, 3425–3427.
14. Clough, R. et al. Anal. Chem. 2006, 78, 6126–6132.
15. Becker, J. S. J. Anal. At. Spectrom. 2002, 17, 1172–1185.
16. Mason, P. R. D. et al. Anal. At. Spectrom. 2006, 21, 177–186.