Direct and Traceable Mass Purity Certification of Protein Standards using LC-ICP-MS/MS

Význam tématu

Analýza absolutního množství proteinů je klíčová pro spolehlivou kvantifikaci v proteomice, farmaceutickém výzkumu a klinických aplikacích. Přímé a stopovatelné certifikace hmotnostní čistoty proteinových standardů zajišťují kvalitu dat a umožňují mezinárodní srovnatelnost výsledků.

Cíle a přehled studie / článku

Studie představuje novou metodu pro přímou certifikaci hmotnostní čistoty proteinových standardů pomocí kapilární LC spojené s ICP-MS/MS. Porovnává dvě kalibrační strategie – vnitřní standardizaci S-obsažným standardem a externí standardizaci pomocí FIA s ICP-MS síranovým standardem – a hodnotí jejich přesnost a opakovatelnost.

Použitá metodika a instrumentace

• Separace proteinů kapilárními kolonnami C4 (150×0,3 mm, 3,4 µm) v gradientu vody a acetonitrilu s 0,2 % kyseliny mravenčí při průtoku 3,5 µL/min.
• Detekce pomocí Agilent 8900 Triple Quadrupole ICP-MS v MS/MS režimu s metodou posunu hmotnosti S→SO (Q1 m/z 32, Q2 m/z 48).
• Vnitřní standardizace: BOC-L-methionin přidán přímo ke vzorku pro korekci injekční variability.
• Externí standardizace: FIA injekce certifikovaného ICP-MS síranového standardu provedené před chromatografií pro výpočet odezvy.
• Přidání CO2 do plazmy k potlačení kolísání odpovědi na síru způsobeného organickým gradientem.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda byla ověřena na čtyřech proteinech (cytochrom C, β-casein, transferrin, BSA) s molekulovými hmotnostmi 12–66 kDa. Obě kalibrační strategie vykázaly srovnatelnou přesnost (standardní odchylky 1–6 %) a naměřené hmotnostní čistoty (92–99 %) se shodovaly s teoretickými hodnotami výrobců. Úplné eluční výtěžky a konzistentní odpovědi potvrzují platnost přístupu.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda poskytuje přímou, citelnou a obecnou kvantifikaci proteinů bez nutnosti proteinově specifických standardů. Umožňuje certifikaci standardů pro QA/QC v biopharmaceutickém vývoji, klinických laboratořích i základním výzkumu proteomiky.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření metody pro malé peptidy, posttranslační modifikace a další heteroatomy. Integrace s mikrofluidními systémy a automatizace přípravy vzorků zvýší throughput a uplatnění v průmyslových laboratořích.

Závěr

CapLC-ICP-MS/MS umožňuje rychlou a stopovatelnou certifikaci hmotnostní čistoty proteinových standardů s vysokou přesností a reprodukovatelností. Obě kalibrační strategie jsou vhodné pro obecné použití v analytické chemii proteinů.

Reference

1. Calderon-Celis F, Ruiz Encinar J, Sanz-Medel A. Standardization approaches in absolute quantitative proteomics with mass spectrometry. Mass Spectrom Rev., 2018, 37, 715–737.
2. Wind M, Wegener A, Eisenmenger A, Kellner R, Lehmann WD. Sulfur as the key element for quantitative protein analysis by capillary liquid chromatography coupled to element mass spectrometry. Angew Chem Int Ed., 2003, 42, 3425–3427.
3. Diez Fernández S, Sugishama N, Ruiz Encinar J, Sanz-Medel A. Triple Quad ICP-MS (ICP-QQQ) as a New Tool for Absolute Quantitative Proteomics and Phosphoproteomics. Anal Chem., 2012, 84, 5851–5857.
4. Calderón-Celis F, Diez-Fernández S, Costa-Fernández JM, Ruiz Encinar J, Calvete JJC, Sanz-Medel A. Elemental Mass Spectrometry for absolute intact protein quantification without protein-specific standards: application to snake venomics. Anal Chem., 2016, 88, 9699–9706.
5. Calderón-Celis F, Calvete JJC, Sanz-Medel A, Ruiz Encinar J. Absolute Quantification of Proteins in Snake Venom using capLC-ICP-QQQ and Online Isotope Dilution Analysis. Agilent publication, 5991-9016EN.
6. Calderón-Celis F, Ruiz Encinar J, Sanz-Medel A. Enhanced Universal Quantification of Biomolecules Using Element MS and Generic Standards: Application to Intact Protein and Phosphoprotein Determination. Anal Chem., 2019, 91, 1105–1112.
7. Cid-Barrio L, Calderón-Celis F, Costa-Fernández JM, Ruiz Encinar J. Assessment of the Potential and Limitations of Elemental Mass Spectrometry in Life Sciences for Absolute Quantification of Biomolecules Using Generic Standards. Anal Chem., 2020, 92, 13135–131508.