Cytosolic expression of Green Fluorescent Protein (GFP) and its derivatives in the yeast Saccharomyces cerevisiae: Detection in vivo using the Agilent Cary Eclipse

Význam tématu

Zelený fluorescenční protein (GFP) a jeho varianty představují klíčový nástroj pro neinvazivní sledování biologických dějů in vivo. Jeho schopnost samovolné maturace a výrazného fluorescence bez potřeby dalších kofaktorů umožňuje studovat buněčné procesy v reálném čase v živých organismech a buňkách bez poškození vzorku.

Cíle a přehled studie / článku

Tato studie se zaměřila na vyjádření GFP a jeho barevných variant (BFP, CFP, YFP) a červeného fluorescenčního proteinu DsRed v cytosolu kvasinky Saccharomyces cerevisiae a jejich detekci pomocí spektrofluorometru Agilent Cary Eclipse. Hlavním cílem bylo ověřit vhodnost přístrojové sestavy pro měření emisních spekter ve živých buňkách.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu byly použity kvasinkové kmeny YRD15 transformované plasmidem pAS1N k exprimování různých fluorescenčních proteinů. Buňky se kultivovaly na selektivním médiu při 28°C, promyly v ultračisté vodě a upravily na OD650 = 0,55. Suspenze se měřila v cuvetách při 25°C v multicell držáku na Agilent Cary Eclipse. Byl použit odpovídající excitační rozsah pro každý fluorescenční protein:

• GFP: ex 395 a 475 nm, em ~509 nm
• BFP: ex ~380 nm, em ~450 nm
• CFP: ex ~433 nm, em ~475 nm
• YFP: ex ~514 nm, em ~527 nm
• DsRed: ex 550 nm, em 583 nm

Hlavní přístrojové komponenty:

• Agilent Cary Eclipse fluorescenční spektrofotometr
• Peltier-thermostatovaný multicell držák
• Teplotní regulátor a sondy
• Magnetická míchadla
• Křemenné kyvety

Hlavní výsledky a diskuse

Emisní spektra všech testovaných proteinů ve fakultním prostředí kvasinek odpovídala literárním hodnotám. Nízký šum z autofluorescence a rozptylu byl dosažen díky vestavěným filtrům v monokromátorech přístroje. Minimalizace autofluorescence se ukázala zásadní především pro BFP, kde UV excitační zdroj aktivuje řadu buněčných komponent.

Přínosy a praktické využití metody

Navržená sestava umožňuje rychlou, reprodukovatelnou a citlivou charakterizaci různých fluorescenčních proteinů přímo v živých buňkách. Metoda podporuje simultánní sledování více barev, usnadňuje studie protein-proteinových interakcí (FRET) a lokalizaci proteinu v různých buněčných oddílech.

Budoucí trendy a možnosti využití

Dalším směrem je rozšíření na vícekanálové měření s automatizovanou excitací a detekcí až šesti různých fluoroforů. Vývoj nových variant fluorescenčních proteinů s vyšší intenzitou, stabilitou a spektrálně posunutými maximy otevře nové aplikace v buněčné a molekulární biologii.

Závěr

Agilent Cary Eclipse s doplňky pro více vzorků a teplotní kontrolu představuje efektivní řešení pro in vivo měření emisních spekter fluorescenčních proteinů v kvasinkách. Umožňuje detailní analýzu a podporuje rozsáhlé biologické aplikace od sledování genové exprese až po studium interakcí proteinu - protein.

Reference

1. Chalfie M. et al. Science 1994, 263, 802.
2. Gerdes H-H, Kaether C. FEBS Lett. 1996, 389, 44-47.
3. Clontech Web Site: www.clontech.com
4. Matz M. V. et al. Nature Biotech. 1999, 17, 969-973.
5. Prescott M. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994, 207, 943-949.
6. Lakowicz J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2nd Edn., 1999.