Monitoring fluorescence resonance energy transfer (FRET) between GFP fusions in lysates of the yeast Saccharomyces cerevisiae using the Agilent Cary Eclipse

Význam tématu

Fluorescenční rezonance přenosu energie (FRET) umožňuje sledovat prostorovou proximitu a vzájemnou orientaci molekul s vysokou citlivostí bez destrukce vzorku. Tato metoda je zásadní pro studium proteinových interakcí, konformačních změn a dynamiky molekul v biologickém kontextu.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo detekovat a sledovat změny ve FRET mezi modrým fluorescenčním proteinem BFP a zeleným fluorescenčním proteinem GFP v cytosolických lyzátech kvasinek Saccharomyces cerevisiae pomocí fluorescenčního spektrofotometru Agilent Cary Eclipse.

Použitá metodika a instrumentace

Buňky byly promyty, lyzovány reagensem Y-PER a lyzáty naředěny v Tris HCl pufru pH 8. Měření probíhalo při 25 °C v kyvetách ve vícenásobném držáku s Peltierovým chlazením. Excitace BFP probíhala při vlnové délce 360 nm a emisní spektra byla snímána od 400 do 550 nm před a po přidání trypsinu (0,25 µg).

• Agilent Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer
• Multicell Peltier thermoelektrický držák
• Regulátor teploty
• Quartzová kyveta 10 mm
• Eclipse Thermal Software Bio Package

Hlavní výsledky a diskuse

Snímky emisních spekter ukázaly výrazný FRET signál kolem 510 nm po excitaci BFP. Po přidání trypsinu došlo k postupnému útlumu emisního maxima GFP a nárůstu signálu BFP, což potvrzuje specifické rozštěpení fúzního proteinu a vyloučení přímé stimulace GFP excitací.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda poskytuje spolehlivý nástroj pro studium proteinových interakcí a konformačních změn in vitro a in vivo. Lze ji využít ve výzkumu, farmaceutickém screeningu i v QA QC biologických vzorků.

Budoucí trendy a možnosti využití

Hlavními směry jsou vývoj nových FRET senzorů s rozšířenou barevnou paletou, aplikace v živých buňkách, vysokopropustné platformy pro screening a kombinace s pokročilými zobrazovacími technikami.

Závěr

Agilent Cary Eclipse s Peltierovým chlazením umožňuje jednoduché a přesné sledování změn FRET signálu v kvasinkových lyzátech. Tento modelový systém je vhodný pro další studie proteinových interakcí pod různými podněty.

Reference

1. Miyawaki et al. (1997) Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin, Nature, 388, 882-887.
2. Ha et al. (1996) Probing the interaction between two single molecules Proc Natl Acad Sci USA, 93, 6264-6268.
3. Cubitt et al. (1995) Understanding improving and using green fluorescent proteins, TIBS, 20, 448-455.
4. Gavin P Prescott M (2001) Cytosolic expression of green fluorescent protein and its derivatives in yeast Saccharomyces cerevisiae Fluorescence Application Note 5.
5. Mahajan et al. (1998) Bcl-2 and Bax interactions in mitochondria probed with green fluorescent protein and FRET, Nature Biotechnology, 16, 547-552.
6. Prescott et al. (1994) Biochem Biophys Res Commun, 207, 943-949.