Minimizing photobleaching of Blue Fluorescent Protein (BFP) using the Agilent Cary Eclipse fluorescence spectrophotometer

Význam tématu

Fotobleaching neboli postupná ztráta fluorescence při opakovaném nebo dlouhodobém ozáření je významným problémem u citlivých fluoroforů, jako je Blue Fluorescent Protein (BFP). Snížení intenzity signálu vede ke zkreslení kvantitativních výsledků, omezuje délku kinetických experimentů a komplikuje techniky založené na sledování změn fluorescence v reálném čase, například ve studiích FRET.

Cíle a přehled studie / článku

Studie se zaměřila na porovnání úrovně photobleachingu BFP při měření pomocí Agilent Cary Eclipse fluorescence spektrofotometru, využívajícího xenonový výbojový zdroj se speciálními pulzy, a konvenčního spektrofotometru s nepřetržitým xenonovým obloukem. Cílem bylo ověřit, zda cyklické pulzní ozáření umožňuje zachovat vyšší intenzitu fluorescence po opakovaných měřeních.

Použitá metodika a instrumentace

Rekombinantní BFP byl exprimován v kvasinkách Saccharomyces cerevisiae (kmen YRD15). Buňky byly lyzovány a suspenze filtrovaného lysátu byla vložena do kuvet umístěných v Peltierem chlazeném držáku s mechanickým mícháním. Spektrální měření probíhala v cyklickém režimu s excitací na 370 nm a detekcí v rozsahu 400–550 nm při rychlosti 120 nm/min.
Instrumentace:

• Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer (Agilent)
• Peltier-thermostatted multicell holder s elektromagnetickým mícháním
• Regulátor teploty a teplotní sondy
• Magnetické míchátko a míchací tyčinky

Hlavní výsledky a diskuse

Měření na Cary Eclipse odhalilo pouhých 2,4% poklesu intenzity špičky BFP (450 nm) po 10 po sobě jdoucích skenech (celkem 21,5 min), zatímco u spektrofotometru s kontinuálním xenonovým obloukem dosáhla fotobleachingu 19,1%. Pulzní xenonový zdroj omezuje dobu, kdy je vzorek ozářen, což minimalizuje destrukci fluoroforu a zároveň prodlužuje životnost lampy.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda zaručuje vyšší stabilitu fluorescenčního signálu u citlivých fluoroforů, umožňuje delší kinetická měření živých vzorků a zlepšuje kvalitu dat v experimentech založených na FRET bez nutnosti snižovat intenzitu světla nebo expozici.

Budoucí trendy a možnosti využití

Využití pulzních xenonových zdrojů lze rozšířit na další fluorescenční proteiny a barviva, včetně technik super‐rozlišení a multiplexních analýz. Možné je také začlenění do automatizovaných a vysokopropustných platforem pro biochemické a farmaceutické screeningy.

Závěr

Použití Agilent Cary Eclipse spektrofotometru s úsporným xenonovým pulzním zdrojem výrazně omezuje fotobleaching BFP a zároveň prodlužuje životnost lampy. Tato vlastnost umožňuje spolehlivá dlouhodobá měření fluorescence s vysokým poměrem signál/šum.

Reference

1. Tsien RY. The Green Fluorescent Protein. Annu Rev Biochem. 1998;67:509–544.
2. Gavin P, Prescott M. Monitoring fluorescence resonance energy transfer (FRET) between GFP fusions in lysates of the yeast Saccharomyces cerevisiae using the Agilent Cary Eclipse. Fluorescence Application Note #9; 2001.
3. Agilent Technologies. Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer – Part Numbers and Accessories. 2011.
4. Prescott M, et al. Biochem Biophys Res Commun. 1994;207:943–949.