The Linear Dynamic Range and Limits of Detection of Fluorescein using the Agilent Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer

Význam tématu

• Fluorescein je široce využívaný fluorescenční štítek s výhodnými vlastnostmi pro biologické vzorky.
• Stanovení lineárního dynamického rozsahu a detekčního limitu je klíčové pro přesnou kvantifikaci v citlivé fluorescenční analýze.

Cíle a přehled studie / článku

• Ukázat schopnost spektrofotometru Agilent Cary Eclipse měřit fluorescein ve 0,01 M NaOH.
• Zhodnotit lineární dynamický rozsah přes pět řádů koncentrací.
• Stanovit limit detekce fluoresceinu a ověřit jej na pěti přístrojích.

Použitá metodika a instrumentace

• Přístroj: Agilent Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer s WinFLR softwarem.
• Kvartzetová kyveta s optickou cestou 10 mm.
• Podmínky měření: excitační/emisní vlnová délka 480/520 nm, štěrbiny 10 nm, čas průměrování signálu 1 s, PMT napětí až 1000 V.
• Řada standardních roztoků fluoresceinu (0,1 pM až 1,06 µM) připravených v 0,01 M NaOH.

Hlavní výsledky a diskuse

• Absorpční a emisní maxima fluoresceinu v roztoku 0,01 M NaOH byla potvrzena (~490 nm / ~515–520 nm).
• Lineární rozsah od 10 pM do 1,06 µM (pět řádů), regrese má r2 = 0,99993.
• Limit detekce při trojnásobku směrodatné odchylky blanku průměrně 0,48 pM (ověřeno i výpočtem z regresní přímky: 0,45 pM).

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká citlivost a nízký detekční limit pro fluorescenční analýzy v biologických aplikacích.
• Široký lineární rozsah umožňuje přímé stanovení i při velkém rozptylu koncentrací.
• Opakovatelné a rychlé měření usnadňuje kvantitativní kontrolu kvality a výzkumné aplikace.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření na nové fluorofory a kombinace multiplexních analýz.
• Integrace se systémy pro automatizované a vysokopropustné měření.
• Vývoj pokročilých softwarových modulů pro vícekanálovou detekci a data mining.

Závěr

• Spektrofotometr Agilent Cary Eclipse prokázal vynikající linearitu a extrémní citlivost při analýze fluoresceinu v 0,01 M NaOH.
• Metoda je vhodná pro přesnou kvantifikaci fluorescenčních sond v širokém rozsahu koncentrací.

Reference

• ASTM E 578 – 07: Standard Test Method for Linearity of Fluorescence Measuring Systems
• ASTM E 579 – 04: Standard Test Method for Limit of Detection of Fluorescence of Quinine Sulphate