Time-resolved Measurements Using the Agilent Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer

Význam tématu

Time-resolved fluorescence je klíčová metoda pro studium biomolekul, která umožňuje selektivně vyloučit autofluorescenci a dosáhnout vysoké citlivosti. Lanthanoidní štítky, zejména komplexní Eu3+, poskytují dlouhá emisní zpoždění a rozsáhlé spektrální oddělení mezi excitací a emisí, což výrazně snižuje šum pozadí a zvyšuje přesnost měření.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem přehledu je představit technické parametry a výhody přístroje Agilent Cary Eclipse pro měření časově rozlišené fluorescence a fosforescence. Popisuje princip pulzního xenonového blesku, režimy sběru signálu, optimalizaci delay time a gate time a ukazuje praktické příklady použití s lanthanoidními komplexy.

Použitá metodika a instrumentace

Instrumentace:

• Agilent Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer
• Xenonová výbojka: 80 Hz, špičkový výkon >75 kW, malý oblouk
• Phosphorescence režim v softwaru bez dalších doplňků
• Software WinFLR pro výpočet kinetiky a životností

Metodika:

• Režimy prompt emission a delayed emission (phosphorescence)
• Nastavení delay time (0–100 µs) k odstranění krátkodobé autofluorescence
• Nastavení gate time (40–200 µs) k maximalizaci dlouhovlnné emise
• Měření času rozkladu Eu3+ v roztoku a v PMMA matrici

Hlavní výsledky a diskuse

Zvýšení delay time eliminovalo spektrální pásmo autofluorescence (~450 nm), zatímco emise Eu3+ (~615 nm) zůstala stabilní. Úprava gate time zvýšila intenzitu dlouhovlnné emise bez vlivu na pozadí. Měření časového průběhu emise Eu3+ v PMMA při 50 µs a 2 µs gate time prokázalo sběr 1 000 bodů za 2 ms s velmi vysokým poměrem signál/šum. Z kinetické analýzy vyplynuly parametry k1 = 2,842 ms–1 a τ = 0,352 ms s nízkou odchylkou.

Přínosy a praktické využití metody

• Diskriminace cílových biomolekul bez interference pozadí
• Využití v imunotestech, receptor-ligand a protein-protein vazbách, cytotoxicitě, enzymových a DNA hybridizačních assay
• Analýza inter- a intramolekulárních interakcí, LRET
• Sledování lokálního prostředí (viskozita, polarita) a konformací proteinů

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se integrace s fluorescenční mikroskopií a automatizovanými mikrotitračními systémy, vývoj nových lanthanoidních komplexů s prodlouženou životností, využití AI pro optimalizaci parametrů a analýzu dat, miniaturizace přístrojů pro high-throughput a terénní aplikace, a multiplexní assay pro současné sledování více analytů.

Závěr

Agilent Cary Eclipse nabízí robustní a flexibilní řešení pro časově rozlišené fluorescence a fosforescence. Řízené parametry delay a gate time umožňují dosáhnout vysoké citlivosti, selektivity a spolehlivosti měření v biochemických a průmyslových aplikacích. Kombinace časově zpožděné emise a fosforescence přináší komplexní vhled do dynamiky biomolekulárních procesů.

Reference

1. Lakowicz JR. Principles of Fluorescence Spectroscopy, 3rd Edn. Springer, 2006.
2. Diamandis EP. Clin. Biochem. 1988, 21, 139-150.