Protein secondary structure elucidation using FTIR spectroscopy

Význam tématu

FTIR spektroskopie umožňuje rychlé a neinvazivní získání informací o sekundární struktuře proteinů, která je klíčová pro pochopení stability, funkce a farmaceutických vlastností proteinů. Analýza amide I a II pásem dává přímý vhled do zastoupení α-helixu, β-skládaných listů, smyček a náhodných struktur a je důležitá při vývoji a kontrole terapeutických proteinů, sledování skládání/rozkládání a při porovnávání konformačních změn za různých podmínek.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo demonstrovat možnosti stanovení sekundární struktury proteinů pomocí FTIR spektroskopie v režimech transmisní i ATR. Autorka popisuje dva přístupy: transmisní měření v BioCell CaF2 a měření pomocí koncentrujícího víceodrazového ATR (ConcentratIR2). Výsledky jsou interpretovány pomocí databázových výpočtů (PROTA-3S) a spektrální dekonvoluce (OMNIC Peak Resolve), přičemž jako modelové proteiny byly použity cytochrom C, concanavalin A a BSA.

Použitá metodika a instrumentace

• Transmisní FTIR: Nicolet iS10 s DTGS detektorem, BioCell™ CaF2 okénka se vzniklým průchodem ~6 μm (vhodné pro vodné roztoky), Smart OMNI-Transmission™ Accessory, 256 scanů, rozlišení 4 cm⁻¹. Bufferové spektrum bylo odečteno pomocí PROTA-3S.
• ATR-FTIR: Nicolet iS50 vybavený MCT detektorem a ConcentratIR2 víceodrazovým diamantovým ATR (10 interních odrazů, úhel ~45°). 10 μL vzorku sušeného na krystalu dusíkem, 256 scanů, rozlišení 4 cm⁻¹. Analýza pomocí OMNIC (Peak Resolve).
• Software a výpočty: PROTA-3S pro databázové odhady sekundární struktury; OMNIC pro druhou derivaci, baseline korekci, spektrální dekonvoluci a integraci oblastí.
• Vzorky a podmínky: proteiny ze standardních komerčních zdrojů; koncentrace v ukázkách 1–12 mg/mL; volba pufru s minimální absorpcí v amide I/II oblasti kritická (fosfátový pufr použit jako příklad).
• Postup dekonvoluce: provádí se druhá derivace k identifikaci komponentních pásů, baseline korekce amide I oblasti a následné fitování špiček; kvantifikace prováděna integrací ploch jednotlivých komponent vůči celkové ploše amide I.

Hlavní výsledky a diskuse

• V surových transmisních spektrách převažují absorpce vody; po odečtení spektra pufru jsou jasně viditelné amide I a II pásy.
• Amide I pozice jsou diagnostické: α‑helix typicky kolem 1650–1655 cm⁻¹ (cytochrom C ukázal 1654 cm⁻¹), β‑složky dávají pásy v nižší oblasti ~1620–1640 cm⁻¹ a vysokofrekvenční komponentu ~1674–1695 cm⁻¹; překryvy vyžadují dekonvoluci pro kvantifikaci.
• Příklad: PROTA-3S odhadl pro cytochrom C ~45 % α-helixu a ~5 % β-skládaných listů; pro concanavalin A přibližně 42 % β-složky a nízký podíl α-helixu. Tyto výsledky jsou ve shodě se strukturálními daty i přes rozdíly plynoucí ze stavu vzorku (roztok vs. krystalická struktura) a odlišných algoritmů.
• ATR měření (ConcentratIR2) se ukázalo výhodné při omezeném množství vzorku; vysoušení na diamantovém krystalu ukázalo vedle amide pásem i signály postranních řetězců (např. 1515 cm⁻¹ – tyrosin, 1498 cm⁻¹ – kyseliny), které pomáhají při posuzování protonačních stavů a prostředí aminokyselin.
• Spektrální dekonvoluce amide I u BSA vedla ke stanovení zhruba 47 % α‑helixu, 3 % β‑sheet, ~24 % smyček a ~26 % náhodných struktur, hodnoty konzistentní s publikovanými FTIR a rentgenovými daty s přihlédnutím k očekávaným rozdílům.
• Důležité praktické poznatky: volba pufru a délky optické cesty (pro transmisi), kontrola koncentrace na ATR povrchu, provedení druhé derivace a baseline korekce před dekonvolucí pro zlepšení spolehlivosti fitu.

Přínosy a praktické využití metody

• FTIR (transmise i ATR) poskytuje rychlé, relativně nenáročné a nízkomateriálové řešení pro stanovení sekundární struktury proteinů v roztoku i pevné fázi.
• Metoda je vhodná pro rutinní kontroly stability proteinů, sledování denaturace/renaturace, vývoj formulací a porovnání konformačních stavů mezi vzorky.
• PROTA-3S a OMNIC umožňují integrovaný workflow: odečtení pufru, druhá derivace, dekonvoluce a kvantifikace — to zjednodušuje implementaci v QA/QC laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Zlepšení hardwaru (rychlejší přístroje, citlivější detektory jako MCT a vylepšené modely) zrychlí sběr dat a zvýší poměr signál/šum, což umožní analýzy při nižších koncentracích.
• Pokročilejší softwarové algoritmy a strojové učení mohou zlepšit automatickou dekonvoluci a interpretaci spekter, včetně robustnějšího rozlišení překrývajících se komponent.
• Integrace FTIR s jinými metodami (CD, NMR, rentgen, hmotnostní spektrometrie) a hyphenované techniky rozšíří možnosti strukturální a funkční charakterizace.
• Miniaturizace ATR a in situ monitoring (např. online během formulace nebo chromatografie) umožní širší nasazení v procesním výzkumu a průmyslové výrobě biologik.

Závěr

FTIR spektroskopie v transmisním i ATR režimu představuje efektivní nástroj pro analýzu sekundární struktury proteinů. Použití vhodného vzorkovacího režimu, správného pufru a pečlivé spektrální analýzy (druhá derivace, baseline korekce, dekonvoluce) vede k výsledkům, které korespondují s literárními daty a rentgenovými strukturami. ATR je preferovanou metodou při omezeném množství vzorku, zatímco transmisní měření v kombinaci s databázovými algoritmy nabízí rychlou kvantifikaci struktury v roztoku.

Reference

1. Elliott A., Ambrose E. J. Structure of synthetic polypeptides. Nature, 1950, 165, 921–922.
2. Jackson M., Mantsch H. H. The use and misuse of FTIR spectroscopy in the determination of protein structure. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 1995, 30, 95–120.
3. Barth A. Infrared spectroscopy of proteins. Biochimica et Biophysica Acta, 2007, 1767, 1073–1101.
4. Byler D. M., Susi H. Examination of the secondary structure of proteins by deconvolved FTIR spectra. Biopolymers, 1986, 25, 469–487.
5. Surewicz W. K., Mantsch H. H. New insight into protein secondary structure from resolution-enhanced infrared spectra. Biochimica et Biophysica Acta, 1988, 952, 115–130.
6. Sukumaran S., Hauser K., Maier E., Benz R., Mantele W. Tracking the unfolding and refolding pathways of outer membrane protein porin from Paracoccus denitrificans. Biochemistry, 2006, 45, 3972–3980.
7. Klose D., Janes R. W. 2Struc – the protein secondary structure analysis server. Biophysical Journal, 2010, 98, 454–455.